分子生物学第十一章分子水平上的同源重组

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DNA断裂频发并启动同源重组

对大多数细胞而言, 用于修复双链断裂的主要机制就是同源重组。有些细胞也可通过被称为非同源末端连接(NHEJ)的较简单机制进行修复。

同源重组(homologous recombination): 是指发生在同源序列间的重组, 通过链的断裂和再连接, 在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。

同源重组的模式

同源重组的“模式”都包括以下几个关键步骤

同源DNA分子的联会;
引入DNA断裂;
链侵入(strand invasion): 在两条重组DNA分子之间, 形成碱基互补的短片段起始区。当来自于亲本分子的DNA分子单链区域与同源双链DNA分子互补链配对结合时, 发生该配对过程, 称为链侵入。链入侵的结果是, 产生了新的双链DNA区域, 这种DNA经常带有一些错配的碱基, 称为异源双链螺旋DNA;
形成Holliday联结体。链入侵之后, 两个DNA分子相互交叉的DNA链联系在一起, 这个交叉的结构称为Holliday联结体。一个Holliday联结体可以通过配对碱基连续的解链和配对而沿着DNA移动。每次移动时, 亲本DNA链上配对碱基断开, 由相同的碱基配对形成重组中间体, 该过程称为分支移位;
Holliday联结体的剪切。在Holliday联结体处切断DNA重新生成两个分开的双螺旋DNA, 从而完成遗传物质的交换过程。这个过程叫做拆分。

Holliday(霍利迪)联结体(Holliday junction): 同源重组链侵入使两个DNA分子相互交叉, 两条DNA双链由于自由旋转而在一个平面上形成四条链时在连接点呈现出的十字形结构, 即为Holliday联结体, 因提出者为Holliday而命名。

异源双链螺旋DNA(heteroduplex DNA): 在两条重组DNA分子之间, 形成碱基互补的短片段起始区。当来自于亲本分子的DNA分子单链区域与同源双链DNA分子互补链配对结合时, 发生了链侵入, 链入侵的结果是, 产生了新的双链DNA区域, 这种DNA经常带有一些错配的碱基, 称为异源双链螺旋DNA。

分支移位(branch migration): 链入侵之后, 两个DNA分子相互交叉的DNA链联系在一起, 形成Holliday联结体, 可以通过配对碱基连续的解链和配对而沿着DNA移动, 每次移动时, 亲本DNA链上配对碱基断开, 由相同的碱基配对形成重组中间体, 该过程称为分支移位。

Holliday模型揭示了同源重组的关键步骤

Holliday模型很好地解释了DNA链侵入、分支移位和Holliday联结体拆分等同源重组的核心过程。

双链断裂修复模型更加准确地描绘了许多重组事件

Holliday模型和双链断裂修复模型异同点:

相同点:

都是从同源DNA分子联会开始;
都是通过引入DNA断裂来引发同源重组的过程;

异同点:

在Holliday模型中, 始发事件是在每条DNA分子的同样区域引入一个缺口;而DSB修复模型中, 始发事件是两条DNA分子中的一条DNA发生双链断裂, 而另一条DNA保持完整。
在Holliday模型中, DNA断裂产生后, 连接进入”链侵入”步骤形成Holliday联结体;而DSB修复模型中, 双联断裂产生后需要一种DNA裂解酶顺序降解DNA分子产生3’端单链DNA区域。
DSB修复模型中, 链入侵后以3’端单链DNA为引物开始修复合成被破坏的DNA片段;而Holliday模型中无此步骤。
DSB修复模型中会产生两个Holliday联结体的重组中间体;而Holliday模型中只产生一个Holliday联节体的重组中间体。
DSB修复模型是不对称的;而Holliday模型是对称的。

同源重组中的蛋白质机器（同源重组蛋白质机制）

以E.coli中的RecBCD途径为例

RecBCD途径

ReBCD酶作用于断裂的DNA分子以产生单链的oNA区域, ReBCD也可协助链交换蛋白质RecA结合到单链DNA末端。另外ReBCD酶提供信息供细胞选择或是降解DNA分子或是发生重组:
RecBCD酶是由3个亚基组成的, RecB,RecC,RecD,并且有ONA解旋酶和核酸酶活性;
RecBCD酶通过双链断裂处进入DNA,并在沿着DNA链移动的过程中解旋, RecB和RecD亚基都是解旋酶, 利用ATP水解的能量解链DNA碱基对。RecB是一个5’-3’解旋酶并且有一个多功能的核酸酶结构域, 而RecD是5’-3’解旋酶, RecC具有识别chi位点的功能。RecBCD在解旋过程中剪切两条链从而降解DNA;
遇到chi位点后, RecBCD的活性发生变化, 它不再依3’-5’方向剪切DNA而是以更高频率剪切另一条链, 结果使一条双螺旋DNA的5’单链延长到3’的chi位点;
RecBCD蛋白直接与RecA结合, 从而使该蛋白质结合到DNA的3’端尾巴上;
RecA蛋白是参与同源重组的关键蛋白质:
RecA蛋白质组装在具有单链DNA区域的DNA分子上, 并促进寻找同源序列;
当碱基互补的区域被认定后, RecA促进这两个DNA分子形成一个稳定的复合体, 并促进链交换;9. RuvC是拆分Holliday联结体的主要的酶, RuvC引起的拆分识别Holliday联结体后, 特异的把两条同一方向的同源DNA链打开一个缺口, 然后重组完成缺口被DNA连接酶连上。

核细胞的同源重组

真核细胞的同源重组具有额外的功能

减数分裂重组(meiotic recombination): 在减数分裂过程中, 同源重组确保染色体正确配对, 从而保持基因组的完整性, 染色体的不恰当分离, 被称之为不分离。这种在减数分裂过程中发生的同源重组被称为减数分裂重组。

减数分裂中程序化生成的DNA双链断裂

Spo11蛋白可以在很多染色体位置上切断DNA, 它对序列没什么选择性, 但却必须发生在减数分裂的一特定时期。

MRX蛋白作用于被切开的DNA末端，以组装类RecA的链交换蛋白

3’端DNA链不被降解, 所以此DNA处理反应称之为5’→3’端切除。MRX正是通过5’→3’的反应, 从而生成长3’端单链DNA, 通常可达1kb或更长。MRX酶复合物还被认为能去除与DNA相连的Spo11。

Dmc1是专一在减数分裂重组中行使功能的类RecA蛋白

真核生物编码两种被充分阐明的、与细菌RecA蛋白同源的蛋白质: Rad51和Dmc1。

多种蛋白质共同促进减数分裂重组

Rad52是另外一个与Rad51相互作用的必要重组蛋白。Rad52启动Rad51 DNA蛋白丝(Rad51的活性形态)的组装。
在真核生物中高度保守的Mus81蛋白, 也为减数分裂所必需, 或许具有Holliday联结体拆分酶的作用。

交配型的转换

交配型转换始于特定位点的双链DNA的断裂

交配型转换始于MAT基因座的双链断裂, 这个反应由特异的DNA切割酶——HO内切核酸酶(HOendonuclease)来完成。

HO引起的断裂, 其5’→3’的DNA切除反应与减数分裂重组的机制一样。所以, 切除依赖于MRX蛋白复合体, 并对5’端的DNA链具有特异性, 而3’端DNA链保持稳定。一旦生成长3’单链DNA尾巴, 它们就结合Rad51和Rad52蛋白(和其他帮助组装重组蛋白-DNA复合体的蛋白质)

交配型的转换是单向性的, 即序列信息(尽管并不是真正的DNA片段)从HMR和HML移动到MAT基因座, 但是绝对不会从反方向进行。

交配型转换是一种基因转变事件，与交换无关

为解释缺少交换事件的基因转变的机制, 提出了一种新的重组模型, 称之为依赖合成的链退火(synthesis-dependent strand annealing, SDSA)。首先在重组位点引入DSB, 经过链侵入之后, 侵入的3’端作为引物启动新的DNA合成。值得注意的是, 与DSB修复途径所不同的是, 一个完整的复制叉在该处形成。前导链和后随链可同时进行DNA复制, 但是与普通的DNA复制不同, 新合成的链自模板上置换下来, 其结果是新的双链DNA片段被合成, 再连接到最初被HO内切酶切断的DNA位点上, 并被MRX切除。

新合成的DNA——其亲本DNA分子信息的完全拷贝, 替代原有的DNA信息。

同源重组机制的遗传结果

同源重组的类型及功能：

DNA 损伤修复：修复双链断裂
同源染色体联会：生物遗传多样性的保证
交配型转换：不同遗传性状之间的转换

同源重组的作用：

造成遗传多态性。
用未损伤的同源染色体 DNA 链来修复因损伤丢失的染色体序列。
重启被停止或损伤的复制叉。
特殊类型的重组还能调控某些基因的表达。
对细菌而言，同源重组的主要生物学作用是修复双链断裂，还能促进细菌间的遗传物质转换，这种遗传物质交换发生在宿主细胞的染色体和经噬菌体转导或细胞结合而进入的DNA 之间。
减数分裂中，使染色体联会配对，准确地分配至 2 个子细胞，保证遗传信息的稳定性，使母本的信息可以遗传给子代。