分子生物学 第十章 DNA的突变和修复

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复制错误及其修复

突变的重要来源:

1. DNA复制的不准确性
2. 遗传物质的化学损伤
3. 转座子DNA元件的插入

复制错误和DNA损伤有两个后果

1. 给DNA带来永久性的改变, 可能改变基因的编码序列或者基因的调控序列;
2. DNA的某些化学变化使得DNA不能再用作复制和转录的模板。

突变的本质

基因突变(gene mutation): 又称点突变或者狭义的突变: 一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何变化, 包括一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换, 而导致的遗传变化。广义的突变称为染色体畸变, 包括大段染色体的缺失、重复、倒位等, 主要有染色体数目和结构的变化。

DNA微卫星(DNA microsatellite): 是一种易发突变的序列, 它对人类的遗传学和疾病的重要性, 这些突变易发序列是简单的2-、3-或4-核苷酸序列的重复, 被称为DNA微卫星。一个为人熟知的例子涉及二核苷酸序列CA的重复。CA重复片段在人类和其他真核细胞染色体上分布非常广泛。复制机器很难精确拷贝这种重复序列, 常常发生”打滑”。打滑使得重复序列的拷贝数目增加或减少, 结果在人群中染色体上特定位置处的CA重复片段长度常常为高度多态性。这种多态性为可遗传突变作图。

flowchart LR
    A[突变的类型] --> B[自发突变]
    A --> C[诱突]
    C --> D[点突变]
    D --> F[碱基替换]
    D --> G[其他更大范围的突变]
    G --> G_1[插入]
    G --> G_2[缺失]
    G --> G_3[重排]
    F --> F_1[转换]
    F --> F_2[颠换]
    C --> E[染色体畸变]
    E --> E_1[缺失]
    E --> E_2[重复]
    E --> E_3[插入]
    E --> E_4[易位]
    E --> E_5[倒位]

错配修复能逃脱矫正读码的错误去除

如果错误插入的核苷酸没有及时被检测到并被替换的话, 序列的变化将永久性地存在于基因组中, 取而代之的是在DNA序列中产生一个永久性的改变(突变)。

检测错配并对之进行修复的机制(保证DNA复制忠实性的最后责任): 由错配修复系统(mismatch repair system)承担, 它将DNA合成的精确性又提高了2~3个数量级。

错配修复(mismatch repair): 是对DNA错配区的修复。通过母链甲基化原则找出母链与子链从而修正子链上错配的碱基。

错配修复系统面对两个挑战:

1. 错误配对是短暂的，它必须扫描基因组寻找错误配对，由于它们在第二轮复制后将被消除，错配修复系统必须很快就发现错误配对并对之进行修复;
2. 系统必须准确地纠正错误配对，即它必须在新合成的链中将错误插入的核苷酸换掉而不能把母链中正确的核苷酸换掉。

大肠杆菌中的错配修复机制：

1. MutS包围着含有纽结的错配DNA;
2. MutS募集MutL和MutH,并且由MutS的ATP酶活性催化ATP的水解;
3. MutH是一种内切核酸酶, 能在DNA上接近错配的位置产生一个切口;
4. 紧接着, 一个外切核酸酶消化切口链, 向着错配方向移动;
5. 最后, 产生的单链的缺口由DNA聚合酶填补并消除错配, 由DNA连接酶接合。

E.coli错配修复系统如何知道两个错配核苷酸中的哪个要被取代呢?

答: E.coli 通过暂时半甲基化对母链进行了标记。

Dam甲基化酶(Dam methylase): 使两条链上的5’-GATC-3’序列中的A残基都甲基化。GATC序列广泛分布于整个基因组中, 所有这种位点都被Dam甲基化酶甲基化。当复制叉经过两条链的GATC都甲基化(全甲基化)的DNA时, 产生的子代DNA双链就是半甲基化的(只有母链是甲基化的)。直到Dam甲基化酶赶上并将新合成的子链甲基化为止, 子代DNA双链将只有一条担任模板的链被甲基化。因此可以被认出需要修复的链。

DNA的损伤

flowchart LR
    A[DNA损伤] --> B[自发损伤]
    A --> C[外界损伤]
    B --> D[水解损伤]
    D --> D_1[脱氨基]
    D --> D_2[去嘌呤]
    D_2 --> D_2_explain[N-糖苷键自发水解, 形成脱嘌呤碱基位点]
    C --> C_1[烷化反应]
    C_1 --> C_11[诱变剂]
    C_1 --> C_12[在鸟嘌呤上的氧发生烷化反应，生成06甲基G与T错配]
    C --> C_2[氧化反应]
    C_2 --> C_2_expain[`电离辐射，产生自由基的试剂生成活性氧簇攻击DNA, 使鸟嘌呤转变为0xoG氧化鸟嘌呤, 能与A或C配对, 具有强烈的致变性`]
    C --> C_3[辐射反应]
    C_3 --> C_31[紫外线]
    C_31 --> C_31_explain[使同一核苷酸链相邻位置上的两个嘧啶之司友生光化学聚合形成嘧啶聚体不能再配对DNA pol 在此终止。]
    C_3 --> C_32[电离辐射]
    C_32 --> C_32_expain[通过直接攻击使DNA双链断裂或者通过间接攻击产生活性氧簇]
    C --> C_4[碱基类似物]
    C_4 --> C_4_expain[结构与碱基类似，因此在制中可插入DNA分子，但其寸不准确，会导致复制中频繁发生错误如5'-溴尿嘧啶为类似物，与 G 错配]
    C --> C_5[键入剂]
    C_5 --> C_5_expain[含有几个多元环的扁平分子, 能插入DNA双旋中同扁平的嘌呤或者嘧啶碱基结合, 类似双螺旋中碱基的相互结合, 堆积导致一个或多个碱基插入, 缺失]

DNA 损伤来源：

1. 细胞内源性损伤因素
   • DNA复制错误
   • 自发损伤包括碱基互变异构、碱基脱氨和碱基丢失等
   • 氧化代谢副产物的攻击等
2. 环境中的损伤因素
   • 辐射(含紫外线、X射线)产生胸腺嘧啶二聚体
   • 化学致癌物(烷化剂、氧化脱氨等)

DNA的自发损伤：水解和脱氨基作用

最频繁和最重要类型的水解损伤是胞嘧啶碱基的脱氨基。在正常的生理条件下, 胞嘧啶可自发进行脱氨基作用, 从而产生非天然的(在DNA中)碱基尿嘧啶。尿嘧啶优先与腺嘌呤配对, 因此, 复制时在另一条链上导入腺嘌呤, 而不是胞嘧啶指导下的鸟嘌呤。

腺嘌呤和鸟嘌呤也易于自发脱氨基, 脱氨基将腺嘌呤转变成次黄嘌呤, 次黄嘌呤与胞嘧啶形成氢键;鸟嘌呤转变成黄嘌呤, 黄嘌呤与胞嘧啶配对。

为什么DNA中有胸腺嘧啶而没有尿嘧啶？

胞嘧啶可以通过自发脱氨基作用形成尿嘧啶, 后者会被修复系统识别为非DNA组成成分, 进而恢复成胞嘧啶。如果遗传物质DNA中含有尿嘧啶, 胞嘧啶脱氨基形成的尿嘧啶无法被维持基因组稳定的检测系统检测到。

DNA损伤：烷化反应、氧化反应、辐射

DNA易于受烷化反应、氧化反应和辐射损害。

1. 在烷化反应中，甲基或乙基基团被转移到碱基的反应位点以及 DNA 骨架的磷酸上。
2. DNA 还易受到活性氧簇的攻击。这些强烈的氧化剂由致电离辐射和产生自由基的化学试剂产生。
3. 另一种碱基损伤时紫外线造成的。260nm左右波长的辐射被碱基强烈吸收, 其后果之一是在同一多核苷酸链相邻位置上的两个嘧啶之间发生光化学融合。
4. γ辐射和X射线(电离辐射)有很高的危险性, 因为它们可使DNA双链断裂, 很难被修复。某些抗癌药物, 如争光霉素也能引起DNA的断裂。电离辐射和像争光霉素那样的试剂, 因能导致DNA断裂, 所以被认为具有诱裂性。

突变还可由碱基类似物和嵌入剂引起

突变还可由可替换正常碱基的化合物(碱基类似物)或能插入碱基间的化合物(嵌入剂)导致复制错误而引起。

碱基类似物(base analog): 碱基类似物在结构上与正常碱基类似, 但是其不同之处使其对细胞又非常危险。因此, 碱基类似物与正常碱基的相似程度足以使其被细胞摄取, 转化成核苷三磷酸并在复制中被插入到DNA中。这些碱基与正常碱基在结构上存在差异, 使其配对不准确, 导致复制过程中频繁发生错误。最有致变性的一个碱基类似物是5-溴尿嘧啶,为胸腺嘧啶的类似物, 溴取代原子的存在使碱基可以通过烯醇互变异构体与鸟嘌呤错配。

嵌入剂(intercalating agent): 嵌入剂是含有几个多元环的扁平分子, 能与DNA中同样扁平的嘌呤或者嘧啶碱基结合, 能导致一个甚或几个碱基对的缺失或插入。如原黄素、吖啶和溴乙锭等均为嵌入剂。

DNA损伤的修复

类型	损伤	酶
错配修复	复制错误	E.coli中MutS、MutL、MutH 人类中MSH、MLH和PMS
光激活作用	嘧啶二聚体	DNA光解酶
碱基切除修复	受损的碱基	DNA糖基化酶
核苷酸切除修复	嘧啶二聚体、碱基上的巨大加合物	E.coli中UvrA、UvrB、UvrC、和UvrD、人类中XPC、 XPA、XPD、ERCC1-XPF以及XPG
双链断修复	双链断裂	E.coli中 RecA和 RecBCD
移损DNA合成	嘧啶二聚体、脱嘌吟位点或碱基上的巨大加合物	Y家族DNA聚合酶，如E.coli中的UmuC

1. 修复复制过程中的错配修复系统
2. 修复酶简单地将损伤逆转
3. 剪切修复系统(excision repair system): 处受损的核苷酸没有被修复, 而是从DNA上被除去。有两种剪切修复, 一种仅仅将受损的核苷酸去除, 另一种将包含损伤的一小段单链DNA去除
4. 重组修复(recombinational repair): 也叫复制后修复, 它发生在复制之后。遗传信息有缺损的子代DNA分子可通过遗传重组从而加以弥补, 即从同源DNA的母链上将相应的核苷酸序列片段移至子链缺口处, 然后再用新合成的序列来补上母链的空缺, 此过程称为重组修复
5. 移损合成(translesion synthesis): 当DNA聚合酶的复制进程被受损碱基阻碍的时候, 一个特殊的移损聚合酶以一种不依靠模板和新合成DNA链之间碱基配对的方式经过受损位点进行拷贝。由于移损合成不可避免地具有很高的错误易发性(诱变性), 细胞在迫不得已的情况下才采用此机制

切除修复(excision repair): DNA损伤的一种修复机制。直接切除受损伤的一条DNA片段, 以其互补链为模板新合成DNA来取代切除的受损片段

DNA损伤的直接逆转

损伤简单逆转修复的一个例子是光激活作用(photoreactivation), 光激活作用直接逆转紫外辐射造成的嘧啶二聚体结构。光激活反应中, DNA光解酶从光线中捕获能量并将其用于断裂连接毗邻嘧啶的共价键。换句话说, 受损碱基被直接修复了。

直接逆转的另一个例子是甲基化碱基0^6-甲基鸟嘌呤上的甲基被去除。在此例中, 甲基转移酶把甲基基团转移到其自身的一个半胱氨酸残基上, 从而使之从鸟嘌呤残基上除去, 甲基转移酶不具有催化性, 一旦接受一个甲基基团就不可再次被使用。

甲基转移酶(Methyltransferase): 也称转甲基酶, 是一种能够引起甲基转移作用的酶, 这种酶在DNA损伤的直接逆转中起重要作用。如甲基化碱基O6-甲基G上的甲基被去除, 这个过程中是甲基转移酶把甲基基团转移到其自身的一个半胱氨酸上, 从而使G残基上除去, 从而使DNA损伤得到修复。

碱基除修复酶通过碱基弹出机制除去受损碱基

DNA清除受损碱基最普遍的方法是通过修复系统将已变化的碱基除去并替换掉。两种主要的修复系统是碱基切除修复(base excision repair)和核苷酸切除修复(nucleotide excision repair)。

碱基切除修复作用机制: 在碱基切除修复中, 一种称为糖基化酶(glycosylate)的酶识别并通过水解糖苷键除去受损碱基。在随后的核酸内切步骤中, 产生的脱碱基戊糖从DNA骨架上去除。

在倾向于和A发生错配的oxoG例子中存在一种防故障机制。一种专门的糖基化酶可识别模板链上oxoG配对位置错误掺入A产生的oxoG: A碱基对。然而在这种情况下, 糖基化酶会除去A。因此, 修复酶把与oxoG配对的A认作突变, 并除去虽没有受损但是却不正确的碱基A。

另一个防故障系统的例子是除去与 G 配对的 T 的糖基化酶。5-甲基胞嘧啶自发的脱氨基作用能形成T:G错配，糖基化酶系统认为，T:G 错配中的 T 是 5-甲基胞嘧啶脱氨基作用产生的,并选择性地除去T使其被C取代。

核苷酸切除修复酶在损伤两侧切割受损的DNA

核苷酸切除修复作用机制: 与碱基切除修复不同, 核苷酸切除修复酶不能区分各种不同的损伤, 而是识别双螺旋形状上的扭曲。这种扭曲引发一连串的事件, 导致含有损伤的一小段单链片段(或小区)被去除。去除修复在DNA上产生的单链缺口由DNA聚合酶用未受损的链为模板进行填补, 从而恢复原始的核苷酸序列。

E.coli核苷酸切除修复机制:

E.coli的核苷酸切除修复主要由4种蛋白质来完成: UvrA、UvrB、UvrC和UvrD。

1. 通过与UvrB形成二聚体的UvrA, ATP水解促进促进二聚体形成UvrA和UvrB扫描DNA寻找扭曲;
2. UvrA离开复合体, UvrB在扭曲附近将DNA局部变性;
3. UvrC与UvrB形成复合体, 在损伤的5’侧和3’侧产生切口;
4. DNA解旋酶UvrD将单链片段从双螺旋上释放出来, DNA聚合聚I和连接酶对缺口进行修复和填补。

高等细胞中核苷酸切除修复机制:

较高等细胞中核苷酸切除修复的原理与E.coli中的基本相同, 但是对损伤的检测、切除和修复系统更为复杂, 涉及25个或者更多的多肽。

1. XPC负责检测螺旋中的扭曲(这在E.coli中是UvrA的职能)
2. 与在E.coli中一样, DNA被变性打开并在损伤周围形成一个凸起。凸起的形成涉及XPA和XPD蛋白的解旋酶活性(E.coli中UvrB的对应物), 以及单链结合蛋白RPA。
3. 凸起在损伤部位的5’端产生的切割位点供核酸酶ERCC1-XPF切割, 在3’端产生的切割位点供核酸酶XPG切割(代表UvrC的功能)。在高等细胞中, 产生的单链DNA片段为24~32个核苷酸。
4. 与在细菌中一样, DNA片段释放后产生的缺口被DNA聚合酶和连接酶填补。

核苷酸切除修复的功能:

1. 能修复整个基因组中的损伤;
2. 当RNA聚合酶的转录过程被某个基因中发生的转录(模板)链的损伤所终止时, 它还能拯救RNA聚合酶。

转录偶联修复(transcription-coupled repair): 核苷酸切除修复能在当RNA聚合酶的转录过程被某个基因中发生的转录(模板)链的损伤所终止时, 能拯救RNA聚合酶。此现象叫做转录偶联修复, 包括将核苷酸切除修复蛋白募集到受阻的RNA聚合酶上。转录耦联修复的意义在于它将修复酶集中于正在活跃地被转录的DNA(基因)上。

重组修复通过从未受损DNA中找回序列信息来修复DNA断裂

在所有的DNA损伤中, DSB是对细胞最有害的。如果不修复, DNA的断裂将引起多种有害的后果, 如阻断复制和引起染色体缺失, 进而导致细胞死亡或肿瘤转化。

如何修复DNA中双螺旋两条链都断裂的双链断裂呢？

这是由双链断裂修复(DSB)途径[double-strand break(DSB)repair pathway]进行的。此途径从姐妹染色体中取回序列信息。
DNA重组还帮助修复DNA复制中的错误。

DNA中的DSB可以直接与断裂末端相连而修复

非同源末端连接(nonhomlogous end joining, NHEJ): 在细胞周期的早期, 两个姐妹染色体由DNA复制产生之前, 如果一个仍未复制的染色体发生了断裂, 就没有姐妹染色体可以作为DSB修复途径的模板了, 此时另外一种称为非同源末端连接的系统发挥作用。NHEJ不涉及同源重组, 通过断裂末端突出的单链之间错排配对, 断裂DNA的两个末端直接相互连接。此错排配对是通过小段(可以短至一个碱基对)互补碱基之间的匹配完成的。

NHEJ中将DNA末端连接起来的机制:

通过断裂末端突出的单链之间错排配对, 断裂DNA的两个末端直接相互连接。此错排配对是通过不同片段(可以短至一个碱基对)互补碱基之间的匹配完成的(偶然发现的微小同源件)。单链尾巴用核酸酶去除, 缺口用DNA聚合酶填补。

移损DNA合成使复制越过DNA损伤继续进行

移损合成(translesion synthesis): 有时正在复制的DNA聚合酶仍会遇到没有被修复的损伤, 即使细胞不能修复损伤, 也有防故障机制使复制机器绕过受损的部位, 这种机制就叫做移损合成。这个机制有高度的易错性, 易引入突变, 但是移损合成使细胞避免了染色体不完全复制的更坏命运, DNA修复路径可以随后修正损伤。

移损合成机制:

1. 复制时一且在模板中遇到损伤, DNA聚合酶III与其滑动夹一起从DNA上脱离下来并被移损DNA聚合酶取代。
2. 移损DNA聚合酶通过不按照碱基配对的方式插入核苷酸来越过损伤进行合成, 插入的核苷酸并不是随机的——有些移损聚合酶插入特定的核苷酸。
3. 越过模板链(上者)上的损伤后继续进行DNA的合成。
4. 然后移损聚合酶被DNA聚合酶III替换。

SOS response

SOS反应(SOS response)或SOS修复(SOS repair): SOS反应是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下, 细胞为求生存而产生的一种应急措施。当DNA两条链的损伤邻近时, 损伤不能被切除修复或重组修复,这时在核酸内切酶、外切酶的作用下造成损伤处的DNA链空缺, 再由损伤诱导产生的-整套的特殊DNA聚合酶-SOS修复酶类, 催化空缺部位DNA的合成, 这时补上去的核苷酸几乎是随机的, 但仍然保持了DNA双链的完整性, 使细胞得以生存。但这种修复带给细胞很高的突变率。

考点补充

DNA损伤以及修复系统

1、试述环境因素对DNA损伤以及生物体中存在的DNA损伤修复系统。如果DNA损伤没有被修复会造成什么后果？(2004)
2、简述DNA损伤的修复的机制, 在什么情况下DNA损伤会引起DNA突变。(2005)
3、什么是DNA损伤？生物体DNA损伤与哪些因素有关？生物细胞有哪些机制来处理DNA损伤, 并进行DNA损伤修复？(2009)

DNA甲基化的意义

1、DNA的甲基化在遗传信息的传递、DNA复制和DNA损伤修复等过程有什么意义？请举例说明。(2006)
2、DNA甲基化对DNA复制和修复的调控。(2022简)

DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰方式, 是指DNA分子的碳基C5上附加一个甲基基这个过程是通过DNA甲基转移酶来完成的, 它可以抑制基因启动子和转录因子的识别和结合, 从而影响基因表达的调节。

甲基化DNA复制的调控: 复制起始的调控与DNA被修饰的情况相关,完全甲基化的复制原点可起始复制,半甲基化的子代复制原点只有恢复完全甲基化状态之后才可被继续利用。

复制后的DNA是半甲基化的,半甲基化DNA对膜受体比对DnaA有更高的亲和力,半甲基化DNA不能复制,从而防止了成熟前复制。

甲基化对DNA修复的调控主要是表现在错配修复过程中:在DNA错配修复当中,一旦复制叉通过复制起始位点,母链就会在开始DNA合成前几秒至几分钟内,被甲基化。新合成的子链来不及甲基化.从而和母链配对形成半甲基化的状态,此后,只要两条DNA链上碱基配对出现错误,错配修复系统就能够通过半甲基化的状态识别错配子链,从而对错配的碱基进行修复.

DNA甲基化在基因组稳定性中起着重要作用。通过甲基化修饰, DNA分子可以保持其结构的稳定性, 从而避免了碱基对的突变和DNA序列的丢失。这对于维持基因组的完整性和遗传信息的传递至关重要。

DNA甲基化在基因表达调控中起着重要作用。DNA甲基化可以影响基因的转录活性, 即影响基因是否被转录成RNA分子。甲基化的DNA序列通常与基因的沉默相关, 而未甲基化的DNA序列通常与基因的活化相关。这是因为甲基化的DNA序列可以与转录因子结合, 阻碍其结合到DNA上, 从而抑制基因的转录。通过这种方式, DNA甲基化可以对基因表达进行精细调控, 确保基因在不同细胞和组织中的表达模式。DNA甲基化为非编码区(如内含子等)的长期沉默提供了一种有效的抑制机制。

基因启动区域内CpG位点的甲基化通过三种方式影响基因转录活性: ÿDNA序列甲基化直接阻碍转录因子的结合;ÿ甲基CpG结合蛋白结合到甲基化CpG位点与其他转录抑制因子相互作用;染色质结构的凝集阻碍了转录因子与其调控序列的结合。

DNA突变

简述突变类型及其遗传效应。(2010)

突变是指遗传物质(DNA序列)发生了改变, 突变可以分为两类

• 染色体畸变: 即染色体结构和数目的改变
• 基因突变: 指基因的核苷酸序列, 种类和数目发生改变, 仅仅涉及DNA分子中的单个碱基改变的称为点突变, 涉及多个碱基的有缺失, 重复和插入

名词补充

translesion replication/repair跨损伤复制/移损合成: 当DNA聚合酶的复制进程被受损碱基阻碍的时候, 一个特殊的移损聚合酶以一种不依靠模板和新合成DNA链之间碱基配对的方式经过受损位点进行拷贝。由于移损合成不可避免地具有很高的错误易发性(诱变性), 细胞在迫不得已的情况下才采用此机制。

Nucleotide excision repair 核苷酸切除修复: DNA 双螺旋结构有较大损伤时。. ①首先由切除酶识别 DNA 的损伤位点，在损伤部位的两侧切开磷酸二酯键。. ②在 DNA 聚合酶的催化下，以完整的互补链为模板，按5’-3’方向 DNA 链，填补已切除的空隙。. ③由 DNA 连接酶将新合成的 DNA 片段与原来的DNA 链连接起来。

作业