时空专题1_时空组学数据基本处理流程与原理_从reads到表达矩阵

❗时空组学数据基本处理流程与原理-从reads到表达矩阵

Stereo-seq技术基础原理

文件

• mask文件: 记录CID序列与空间位置的文件
• image文件: 图像质控结果文件
• Fastq文件: 转录粗测序数据文件

芯片

• 芯片大小: 1cm*1cm
• 纳米球尺寸: 直径220nm
• 纳米球间距: 500nm
• spot数量: $4\times10^8$个
• barcode长度: 25bp, $4^{25}种$
• UMI长度: 10bp
• CID: 25bp

数据分析SAW(STOmics analysis workflow)整体流程介绍

SAW github link

Stereo-seq

SAW 处理 Stereo-seq 的测序数据以生成空间基因表达矩阵，用户可以将这些文件作为起点进行下游分析。SAW 包含十三个基本和建议的流程和辅助工具，以支持其他便捷功能。

输入文件

reference

• 输入文件
  • 基因组序列文件: genome.fa
  • 基因注释文件: genes.gtf$/$gff

.
└── specieName
    ├── STAR_SJ100
    │   ├── Genome
    │   ├── SA
    │   ├── SAindex
    │   ├── chrLength.txt
    │   ├── chrName.txt
    │   ├── chrNameLength.txt
    │   ├── chrStart.txt
    │   ├── exonGeTrInfo.tab
    │   ├── exonInfo.tab
    │   ├── geneInfo.tab
    │   ├── genomeParameters.txt
    │   ├── sjdbInfo.txt
    │   ├── sjdbList.fromGTF.out.tab
    │   ├── sjdbList.out.tab
    │   └── transcriptInfo.tab
    ├── genes
    │   └── genes.gtf
    └── genome
        └── genome.fa

4 directories, 17 files

• 输出文件
  • 参考基因组索引目录: /path/to/genomeDir
• 检查索引文件的小工具
  • SAW: checkGTF
• 参考脚本: example script

mask

• 格式: *.h5

image

• 格式:
  • SN*.ipr
  • SN*.tar.gz

fastq

PE format

• read1 = CID + MID
• read2 = mRNA
• 不需要splitMask
  SE format
• read_name = CID + MID
• read = mRNA
• 需要splitMask

流程

mapping 比对

• Step1 BarcodeMapping: 原始测序读取（存储在FASTQ文件中）的CID与Stereo-seq Chip T MASK文件中保存的CID-坐标键值对记录进行匹配（允许1个错配）。根据MASK文件中的记录，为可以配对的读取添加坐标信息。获得坐标注释的读取被称为有效CID mRNA读取（有效CID读取）。
• Step2 Filtering:
  • 丢弃不合格的MID读取（不满足进一步分析要求）
  • 过滤含有接头adapter的读取
  • 过滤长度(去除poly-A后)小于30的短读取
• Step3 GenomeMapping: mRNA比对到参考物种基因组
  输出文件:
• BAM格式比对结果文件:
  • *.Aligned.sortedByCoord.out.bam
  • tag列包含每条reads的空间位置信息
• 比对结果数据统计文件
  • *_barcodeMap.stat: BarcodeMapping信息
  • *.Log.final.out: GenomeMapping信息
  • *.barcodeReadsCount.txt: 每个barcode的reads数

merge 合并

count 注释

注释类型	注释逻辑
Intron类型	reads与intron有超过50%的overlap
antisense统计	比对上任意反链的gene
transcriptome统计	注释上exon或intron且同链

输出文件

• BAM格式比对结果文件与GEF格式表达矩阵
  • *.Aligned.sortedByCoord.out.merge.q10.deduo.target.bam, Tag列新增了注释成功的基因信息
  • .raw.gef, 基因表达矩阵
• 日志文件
  • logs/Bam2Gem_data_time.log, 记录了被跳过的基因

register/rapidRegister (图像)配准

基于空间位置信息, 将影像图最优映射到基因表达矩阵上
配准逻辑:

• 基于TrackLine配准
  • 选模板(scale & rotation)
  • 根据模板推全局
• 算法原理
  • 重心法
• 修正/微调
  • 根据TrackLine进行微调

tissueCut 组织分隔

在影像图上获取组织边界

• 有ssDNA图像: 基于影像图分隔
• 无ssDNA图像: 基于表达矩阵分隔
  基于组织分隔掩模图, 结合矩阵进行组织区域表达矩阵提取, 输出SN.tissue.gef

spatialCluster 空间聚类

筛选高变菊英后进行PCA和UMAP降维, 再使用Leiden等算法进行聚类分析

saturation 饱和度计算

根据饱和度曲线判断数据是否需要加测

$$sequence~saturation=1-\frac{Unique~Reads}{Total Reads}$$

report 报告输出

[{"url":"/img/obsimg/SAW_v7.1_workflow.png","alt":"img"}]

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[{"url":"/img/obsimg/SAW_pt_v7.1_workflow.png","alt":"img"}]

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